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[交流] 免疫荧光常见问题

1.问:免疫荧光:用免疫荧光方法做同样的内容,组织切片和培养细胞,两者操作过程中有哪些不同?
参考见解:只是固定方法不同,细胞固定用甲醇,切片固定用多聚甲醛,而染色方法是一样的.

2.问:近期要做免疫荧光双标,不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤以及注意事项
参考见解;我正在做冰冻组织切片的免疫荧光的双染。有些体会:
       1.选取primary antibodies时要来源于两种不同的动物,我用的是来源于rabbit和rat的抗体,secondary antibodies则是不同荧光信号标记的,我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
       2 我的做法是两种primary antibodies同时孵育,然后两种secondary antibodies同时孵育。抗体浓度、孵育时间要认真摸索,我感觉primary antibodies 4度孵育过夜比较好,背景比较干净。
       3 我的阳性对照采用的是阳性组织切片,阴性对照则分别是rabitt和rat的IgG, 荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
       4 Block用的血清使secondary antibody来源动物的血清,我的是10%的正常donkey血清。
       5 其余同一般操作。

3. 问:本人拟做Brdu标记神经干细胞免疫荧光,二抗为FITC标记,想请教各位大侠
       1、抗体分装、及荧光显微镜观察结果是否一定要在暗室中进行实验?
       2、封片时是否用甘油缓冲液即可,还是用甘油和0.5mmol/lPH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等量混合封片?
       3、有无相应的实验方法参照?
       4、免疫酶染色中的3%过氧化氢及2N盐酸是否还需要用?
参考见解:你的二抗是用FITC标记的,为避免荧光分解,分装及荧光显微镜观察时均要避光;
       2、封片最好用甘油加0.5mmol/lPH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液,后者能使玻片透明‘更亮;
       3、关于免疫酶染色,如果是用过氧化物酶做标记,就必须用3%H2O2以去除内缘性过氧化物酶;
       4、如果要做苏木素复染,可用盐酸溶液去除苏木素。

4. 问:做间接法免疫荧光染色,要怎么设置对照?不是很明白
参考见解:最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照,看是否非特异性染色
       空白对照:如果你作的是石蜡切片的免疫组化,这一个对照必须有,目的是看自发荧光.脱蜡后直接在荧光显微镜下观察.
       2.阴性对照:标本直接滴加二抗,呈阴性反应.
       3.抗原对照:标本加同种动物的未免疫血清,以PBS冲洗后,在加抗免疫球蛋白荧光抗体.因未免疫动物的血清中无特异性抗体,应呈阴性反应.

5. 问:我做乳腺组织的免疫荧光染色,结果用激光共聚焦显微镜看很好,有阳性信号,阴性对照组也没有荧光,但是拿到荧光纤维镜下看,我的阴性对照组一片绿,像非特异性染色,到底哪个结果才是真实的呢?
参考见解:激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多,出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题,如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因,荧光显微镜没有问题,那就以共聚焦显微镜的结果为主!
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