ATCC支原体检测 | 转染试剂ATCC产品订购指南
返回列表 回复 发帖

膜蛋白结构解析

以下翻译自膜蛋白结晶与结构解析高手So Iwata教授编写的《Methods and results inmembrane protein crystallization》。So Iwata教授本人曾解析十多个膜蛋白的晶体结构,包括细胞色素c氧化酶、半乳糖苷通透酶、植物光系统II等。现在英国帝国理工大学任职,研究兴趣在于G 蛋白偶联受体(GPCR)的结构解析,因为市场上30%以上药物的设计是以GPCR为靶点的。GPCR共分五大家族,800多种,但是目前只解析了其中两 种的结构,一个是与视觉相关的视紫红质,一个是肾上腺素受体,相关文章均发表于Nature或science上。

本人翻译了本书的两章,第一章是概略,如下。

序言

经常有人问我:成功获得膜蛋白晶体的诀窍是什么?我的答案总是:无窍即窍。 没有人成功生产一种神奇的溶液用于膜蛋白结晶。因此,我并不坚守于一种特殊方法,而是尝试所有可能的方法。这种柔性,连同一些巧合,可能是成功的关键。不幸的是,这种确定本身不能帮你覆盖膜蛋白结晶的筛选条件的整个多维空间。因此,我们需要一个明晰的策略尽可能有效地覆盖最多的相关条件。我认为,理解膜蛋 白结晶的原理以及从成功例子中汲取经验,是更合理和有效地筛选的关键。基于这个策略,这本书被编写。我收集了尽可能多的成功结晶膜蛋白的例子,并提供章节来总结这些结果。同时,还包括其他章节涉及膜蛋白的基本原理,如相图和膜蛋白晶体的分类。我希望这种结合对于设计您的结晶实验有所帮助。最后,我对于刚开 始进行膜蛋白结晶的人的建议是:努力思考,努力工作。

I 介绍

膜蛋白结晶仍旧是结构生物学领域的最大挑战之一。这本书《膜蛋白结晶的方法和结果》的编写就是为了帮助研究人员结晶自己的膜蛋白。在这第一章,我们总结了与其他章节有关的膜蛋白结晶的关键方面。

1.
如何使用这本书
我 们假设,对于本书读者来说,不必解释膜蛋白结构研究的重要性,因为这本书是为想要结晶自己的膜蛋白的研究人员提供帮助。目前,仍没有通用的方法来获得膜蛋白晶体。然而,通过理解膜蛋白结晶的一些理论原理,以及通过从成功的例子中汲取经验,从而有可能极大地增加获得晶体的机会,并在此过程中节省时间或费用。 在这本书中,我们将集中在(1)新发展的技术的理论和实际方面,(2)成功结晶的例子,(3)找到初始结晶条件的实用方法。在这一章,我们已经总结了膜蛋 白结晶的一些基础,并给出了这本书其他章节的介绍。

1.1膜蛋白的溶解和纯化
膜蛋白被包埋在脂双层中,含有 一个暴露于溶剂的亲水表面和一个埋在脂双层中的疏水区(图1.1)。为了从脂双层中溶解膜蛋白,使用一种所谓的温和去污剂。这种去污剂通过覆盖蛋白质的疏水表面产生一个蛋白质-去污剂胶束,从而模拟脂双层。成功结晶的关键常常在于膜蛋白的纯化(第I部分)。膜蛋白的纯化方法类似于可溶性蛋白;二者通常都使 用层析技术。然而,膜蛋白常常与层析介质有很强的相互作用,从而导致较低柱效。这使得亲和层析可能成为膜蛋白纯化的一种很好的选择(第13和14章)。等 点聚焦是另一种有用的方法(第10章),尽管有时膜蛋白复合物会在此过程中解离。有一些是膜蛋白特异的纯化方法,如用特殊去污剂/条件进行选择性增溶(第 15章)。一般推荐蛋白质要尽可能地纯,然而过纯也可能是一个问题,特别是对于大膜蛋白复合物。这些蛋白质经常含有松散结合的亚基和磷酸化分子等结构组分,它们可能在纯化步骤中解离。这种蛋白质的一个例子在第11章给出。在此种情况下,一种相对不纯的样品可产生衍射良好的甲酸脱氢酶N晶体,相反,若纯化蛋白质至同质则导致一些亚基的丢失。
此外,不同的纯化方法可能导致不同的晶形,例如细胞色素bc1复合物(第12章)。

1.2 膜蛋白的结晶
一 旦膜蛋白被成功溶解和纯化,结晶试验即可进行。根据晶体如何形成,膜蛋白晶体可分为三类。其中,2D晶体原则上是用于电子显微镜的重组生物膜,在此不作讨论。相反,我们将聚焦于3D晶体,它被用于X射线晶体学。它们被命名为I型和II型晶体(图1.1)实际上,经常可能获得介于I型和II型之间的晶体(第 5和7章详述)。
I型晶体是堆叠的2D晶体。这些晶体通过重组膜的疏水相互作用和每个堆叠层之间的极性相互作用而被稳定。由于很难在结晶过程中同时增强疏水相互作用和极性相互作用,大I型晶体经常难以获得。然而,最近一种脂立方相被报道对于产生I型晶体非常有用(第3和4章)。脂立方相是一种三维连续脂相,通过它使得I型晶体形成的机制尚不是很清楚。这种技术看来对于疏水膜蛋白是最有用的,因为它允许分子间经由疏水表面的直接接触(第5章)。 这种方法的另一个优势是,所得晶体拥有低溶剂含量,通常衍射很好。迄今,仅相关蛋白质即菌紫红质、嗜盐菌紫质和感觉视紫红质II的结构已通过此方法得到解 析,但是这种方法有可能应用于其他类型的膜蛋白。第3和4章主要讲述此方法。第3章解释脂立方相结晶的原理,第4章给出如何进行立方相结晶的实际细节。
    已获得的或尝试的最普遍的膜蛋白晶体类型是II型晶体。II型晶体是用类似于可溶性蛋白的技术和沉淀剂(如PEG或硫酸铵)生长的。然而,去污剂的存在对晶体的形成有阻碍性影响。第一个问题是蛋白质-蛋白质接触(对于晶格形成非常重要)仅仅只能通过膜蛋白的亲水表面来介导,覆盖疏水区域的去污剂分子阻碍了特异的蛋白质-蛋白质接触。由于这些特性,II型晶体经常拥有高溶剂含量(65-80%),并且晶体中很少有蛋白质-蛋白质接触,从而 导致很差的晶体质量。去污剂选择对于获得最可能好质量的晶体是非常重要的。对去污剂性质和选择的详细讨论在第2章给出。这里,我们总结去污剂大小对晶体堆 积的影响。

1.3 去污剂选择
    非离子型或两性离子型去污剂经常用于结晶。最成功使用的去污剂分是非离子型带有C8-C12烷 基链的烷基糖(第7和17章)。较长链的去污剂常常在蛋白质旁形成较大的胶束,因此拥有较高的溶剂含量,这常意味着晶体质量较低。因此,看来短链去污剂优于长链去污剂。不幸的是,生活并不是那样简单。膜蛋白常常在长烷基链去污剂中是更易溶的和更稳定的,如Triton-X、十二烷基麦芽糖苷和C12E9,因为它们更接近于模拟细胞膜。因此,我们需要在这两种极端下找到一个折中;实际上,所有α型膜蛋白结晶的最成功去污剂是十二烷基麦芽糖苷(C12),第二位是辛基葡糖苷(C8)(第17章)。有时,在长链去污剂(易于溶解蛋白质)中制备样品而在结晶时添加短链去污剂,是非常有用的。这种方法被成功用于获得细胞色素bc1复合物的P65型晶体。在此种情况下,蛋白质在十二烷基麦芽糖苷中制备,结晶时一种短链去污剂HECAMEG作为添加剂被加入。

1.4 抗体方法
    如 上文所提到的,使用短链去污剂结晶是有优势的,但是有限的溶解度和稳定性意味着不可能将它们用于某一些蛋白质。我们该如何做呢?一种方法仅适合于拥有大的亲水表面的膜蛋白,如细胞色素bc1复合物或甲酸脱氢酶(第11章图11.3)。这是我们实验室所采用的方法之一。如果你的靶蛋白有一系列同源物,你可尝 试用于拥有最大亲水结构域的那个。这可能增大成功结晶的机会。然而,经常必须针对一种没有大的亲水结构域的特异靶蛋白。在此情况下,可考虑延伸蛋白质的亲水表面。尽管可以用不同的方法延伸表面,迄今抗体片段(Fv或Fab)看来是最成功的。这种方法最初被发明用于易化Paracoccus denitrificans细胞色素c氧化酶的结晶,并且已被成功应用于酵母细胞色素bc1复合物和KcsA钾通道。这种技术很耗费时间,但是当蛋白质高度疏水时或不可能从天然蛋白获得晶体时,是值得一试的。此技术的原理在第5章被总结,实际方面被描述于第6章。

1.5 我们从哪儿开始?
现 在你对膜蛋白结晶的理论有了整体了解,你从哪里开始呢?一些理论方法如使用相图,对于晶体的最优化是极其重要的(第7和9章)。然而,找到初始条件、实际 方法包括稀释矩阵筛选,经常是更有用的。不幸的是,市场是没有理想的膜蛋白筛选工具包。在第17章,我们基于报道的条件,描述了一个新的膜蛋白(全部是α 型)筛选工具包和策略。我们不能宣称这是一个理想的初始筛选,尽管我们基于这种方法已经成功获得达到10个不同的膜蛋白晶体。因此,对于任何新的膜蛋白都 值得试一试。对于外膜蛋白,第7章提供了一个全面分析,第16章描述了结晶的极好例子。这些章节应该对于寻找这些类型蛋白质的起始点是非常有用的。第7和 17章分析的一些例子的实验细节在附录数据表中被提供。
你已经试了上述所有方法仍旧未能得到任何晶体?最好的选择是尝试结晶你的靶蛋白的一些 同源物。这个方法对于通道/转运体蛋白包括MscL机械敏感通道、MsbA ABC转运体和ClC氯通道,是非常成功的。在这本书中,你能在第14章发现这种方法的例子,它描述MscL机械敏感通道的结晶。
高通量结晶 技术在获得膜蛋白晶体中是非常有用的,因为必须比可溶性蛋白筛选更多的条件(由于去污剂的额外维度)。为了获得MsbA ABC转运体的晶体,超过96,000个条件被试过。在第8章,Naomi Chayen描述了使用油板法进行膜蛋白结晶,它比传统的蒸汽扩散法更适合于自动化。

1.6 结论
    希 望这本书将给您提供结晶靶蛋白的提示。然而,你绝不应该忘记:你的样品质量是成功结晶的最关键因素之一。例如,严重聚集的样品绝不会产生晶体。在任何结晶实验前认真弄清你的蛋白的特性,是非常重要的。蛋白质结晶决不是一个像DNA测序那样的常规步骤,但是它充满了乐趣。祝你结晶好运!

 

相关主题


     Anatrace——膜蛋白研究利器

     膜蛋白

     可高效纯化生物素化蛋白质的Streptavidin Mag Sepharose™

     没有系统?一样做纯化!GE蛋白纯化预装柱产品促销4.1-5.15

     有黄曲霉毒素纯化的填料吗?

中原公司店小二竭诚为您服务,有任何问题请call店小二:4008100881
膜蛋白的增溶去污剂2.1 介绍
去污剂对于膜蛋白研究非常重要。为了在增溶膜蛋白的同时保留其活性功能,非离子型去污剂最常被使用。离子型去污剂如SDS在提取过程中非常有效,但是常会使 蛋白质解折叠,并且有时是不可逆的。两性离子型去污剂是一个特殊类型,尽管它带电荷,但是常常可以在有效提取膜蛋白的同时保留其天然结构。CHAPS和 CHAPSO是多年使用并获大量成功的两性离子型去污剂。这两种去污剂是基于胆汁盐家族的不同分子拓扑学。具有更典型结构(非极性尾/极性头部)的两性离 子型去污剂包括烷基磺酸甜菜碱(Calbiochem的ZWITTERGENT系列),短链磷脂胆碱(Avanti和其
他公司有售)、溶血磷脂胆碱和一系列磷脂胆碱相关去污剂(FOS-CHOLINER,FOS-MEATM和CYFOSTM),以及目前由Anatrace公司提供的去污剂。
2.2 去污剂所必需的
膜 蛋白的天性使得它与非溶解相结合,为了纯化和进行3D结晶实验则必须用去污剂提取。目的是寻找去污剂或去污剂和试剂的混合,它们可以破坏膜结构但不破坏所溶解蛋白的原始结构。一般地,对于膜外在蛋白来说很容易实现此目的,它们多为水溶性的,并通过肽链或与脂质的共价相互作用从而锚定于膜上。更具挑战性的工 作是成功提取膜内在蛋白,它们大部分包埋在膜内。这些蛋白质常常需要相对浓度的去污剂溶液,甚或添加有机溶剂。
当一种去污剂被加入含有双分子层的溶液,去污剂分子将开始在水相和膜表面(此处诱导局部膜解体)之间分配。加入的去污剂越多,膜将会越饱和,最终破裂成由去污剂和脂质构成的混合胶束。此时,膜蛋白也将成为混合胶束的一部分,有希望保留近似天然态的结构。
提 取一种特殊膜蛋白的去污剂的选择不是很明显的。TRITONR X-100(许多聚氧乙烯去污剂之一)、辛基吡喃葡糖苷和十二烷基麦芽糖苷,是经常使用的。然而,我们提前并不知道哪一种是有效的,并且会发现去污剂和其他特殊试剂(如甘油或其他盐)的联合可能是最优的。例如,非去污剂磺酸甜菜碱在与去污剂结合时有可能对于蛋白质纯化是有用的。
2.3 各种去污剂的要求
2.3.1 对于每一种膜蛋白是不同的
     如上所述,研究人员要测试最佳的去污剂和条件来破坏膜,同时在活性或天然构象下增溶感兴趣的膜蛋白,从而为纯化、鉴定和随后可能进行的双分子层重组等做好准备。此过程的最新例子被给出,即HIV-1基本辅受体CCR5的提取和纯化。作者报道他们测试了18种去污剂,发现其中三种适合于CCR5的提取。一种 是dodecyl-β-D-maltoside,它是提取多种膜蛋白时使用的温和去污剂。另两种去污剂是环烷基糖苷CYMALR-5和CYMALR-6。CYMALR-5被认为最好,因为CCR5在含有缓冲液的CYMALR-5中4℃可保持天然构象许多天,并且比DDM中CCR5更有效地与HIV-1 gp120结合。CYMALR-5也具有这三种去污剂中最高的CMC值,从而更容易移除以进行结晶或重组成膜。
2.3.2 基于糖的去污剂
    基于糖的去污剂是膜蛋白最常用的去污剂类型。烷基吡喃葡萄糖苷系列从六碳链尾一直到十二烷基葡糖苷,这些物质的极性稍差一点的硫苷类似物也是可用的。己基葡糖苷(n=5)含有最高的CMC值(0.25M),这表面含有更短链的去污剂是不能用的。癸基葡糖苷(n=9)含有合理的CMC值,但是溶解度在最低边 缘(表2.1)。十二烷基葡糖苷(n=11)更难溶。
    对很多膜蛋白来说,麦芽糖苷系列的成员比葡萄糖苷系列相对的成员更温和也更有效。麦芽糖苷头基的另一个优势是,相比于葡糖苷系列,麦芽糖苷系列的较高级成员的溶解度有所增加。即使十六烷基麦芽糖苷(n=15)也是可溶的,虽然必须加热几分钟到50℃以使其成为真正的溶液(见2.5.3)。这个系列的麦芽糖 苷型去污剂包括从己基麦芽糖苷到十六烷基麦芽糖苷,除十五烷基麦芽糖苷以外。
    因为麦芽糖苷去污剂一般比葡糖苷去污剂更温和,人们可能认为麦芽三糖苷去污剂会更适于膜蛋白。十二烷基麦芽三糖苷目前已由Anatrace公司出品。具有更大头基的去污剂看来是不实用的,因为纯的更长的多糖则价格不菲。
    两种已被使用的基于糖的去污剂是蔗糖单十二烷酸酯(n=10)和蔗糖单癸酸酯(n=8)。像基于麦芽糖的去污剂系列一样,这些去污剂也是温和的,并可用于 膜蛋白的提取。然而,研究人员应该注意到,这些去污剂是酯类,而不是糖苷类物质,因此在很容易在酸、碱中水解或被蛋白酶水解。蔗糖酯型去污剂也是同分异构体的混合物,其中脂肪酯被连接到蔗糖结构的三个伯醇中任何一个。
    Mega去污剂是另一系列的葡萄糖衍生物,在烷基尾巴和葡糖苷头基之间由酰胺键连接:n=6、7、8,MEGA-8、9、10。Megas已经被用了20 多年,并且用于大量的研究。作为基于糖的去污剂,它们很容易制备,因此价格合理。不幸的是,它们的溶解度很低,因为烷基链有所加长。为了克服低溶解度问题,Anatrace公司已经开发了一个类似的系列:n=6、7、8、9,HEGAR-8、9、10、11。注意一个额外羟基的添加导致溶解度的增加。
2.3.3 脂类去污剂
2.3.3.1 FOS-CHOLINER去污剂
    此系列的去污剂和磷脂具有相同的头基,但是与磷脂不同的是它们只有一个疏水尾巴。一个复杂甘油酯链的缺少使得这些去污剂可以被以适度的价格(相对于许多磷脂)制备和提供给研究人员。同样注意到这些去污剂没有手性中心,而在磷脂或多数磷脂衍生物中是存在的。FOS-CHOLINER-12(十二烷基磷脂胆碱)胶束已被证明,在进行膜蛋白的NMR研究时作为介质是极其有用的,同时在最近提出的一种重折叠错误折叠蛋白质的方法中起到关键作用(见2.4.2)。
   
2.3.3.2 FOS-MEATM去污剂
     FOS-MEATM去污剂的头基有仲胺,取代了FOS-CHOLINER去污剂中的季胺。
2.3.3.3 FOS-CHOLINER -ISO-9
    对于上述磷脂类似物去污剂,Anatrace公司已经增添了FOS-CHOLINER -ISO-9,它有一个裂开的疏水尾巴将更多的疏水性包装在一个较短的有效链长中。这种去污剂可能对于结晶过程中稳定蛋白质有用。
2.3.4 环己基烷基去污剂
    CYMALR系列是尾巴有环己基的第一种去污剂系列:n=1~7,CYMALR-1~7。这些去污剂的CMC值比含有相同碳原子数的对应线性链的要更高。换种方式看,环己基尾巴包装了更多疏水性到一个较短的有效链长中。一些研究人员已发现此系列去污剂的有用性。
    C-HegaR去污剂同样具有在尾巴上具有环己基,以及与HegaR去污剂一样的头基。CYFOSTM去污剂将磷脂头基和一个含有环己基的脂肪尾巴结合起来,这些去污剂类似于前面讨论的FOS-CHOLINER去污剂。
2.3.5 聚氧乙烯去污剂
    聚氧乙烯去污剂的分子式简写为CxEy,x是脂肪尾的碳原子数,y是去污剂头部的乙氧基数。这些商业去污剂作为膜蛋白的提取工具,已由多年使用历史,因为它们很方便拿到并且不贵。如同2.5.4将要描述的,这些物质常常是异质的,并经常含有令人讨厌的能够化学修饰许多蛋白质的杂物。其他工业去污剂是 CxEy去污剂的堂兄弟姐妹,包括TRITONR系列和TWEENR系列。
2.4 CYFOSTM,FOS-MEATM和FOS-CHOLINER去污剂的生化测试
2.4.1 脂增溶
     CYFOSTM-2,3,4,FOS-CHOLINER-8,10,12,和FOS-MEATM-8,10,12去污剂被测试了它们增溶普通磷脂—棕榈硬 酯酰磷脂酰胆碱(POPC)的能力,浓度从200mM到50mM,缓冲液中含有50mMHEPES、300mM NaCl和1mM EDTA,pH为8.0。九个去污剂中的六个能够完全溶解POPC,判断标准是在几次冷冻-解冻(液氮vs50℃温浴孵化)循环后澄清溶液的形成。对于 FOS-CHOLINER-8来说,增溶几乎是彻底的,但是溶液保留轻度浑浊。对于FOS-MEATM-12和CYFOSTM-2来说,溶液保持不透明, 表明这两种去污剂对POPC的增溶不太有效。
2.4.2 由FOS-CHOLINER,CYFOSTM和FOS-MEATM易化的一种错误折叠膜蛋白的重组重折叠
    大肠杆菌二酰甘油激酶(DAGK)是一个同源三聚体内在膜酶,每个亚基含有三个跨膜片段,被认为是螺旋。这种酶可在胶束溶液中用金属离子螯合物层析被纯化至同质,在起始的膜提取/增溶以及最后从金属离子螯合树脂上洗脱纯酶,都要使用各种去污剂。已发现这种酶的野生型和突变形式在以此方式纯化后,都有动力学捕捉的错误折叠率,某些突变体错误折叠率非常高(>95%)。一种特殊的双分子层重组即“重组重折叠”,导致错误折叠蛋白的有效重折叠。一旦重折 叠,酶就保持其适当的折叠构象,即使当含有DAGK的囊泡重溶于去污剂。步骤总结于图2.1。原始报道的步骤严格依赖于最终纯化和重组步骤中FOS- CHOLINER-12作为去污剂的使用。其他被测试的去污剂没有发现能够易化重折叠。在介绍完结构相关的CYFOSTM和FOS-MEATM去污剂后, 我们测试了这些去污剂以看其是否能在DAGK的重组重折叠中替换FOS-CHOLINER-12。初步结果(未示出)表明FOS-MEATM-8、 CYFOSTM-2、CYFOSTM-4、FOS-MEATM-10和CYFOSTM-3都能起到与FOS-CHOLINER-12类似的作用,既能维持 DAGK的溶解度又能易化DAGK的重折叠,而且后两者产生颇具希望的结果。
    这些实验之后又是额外的实验,在重组重折叠的纯化步骤和随后的重组过程中用2%FOS-MEATM-10和3% CYFOSTM-3替换FOS-CHOLINER-12(图2.1)。所有程序上的细节保持不变。严重错误折叠突变体的结果如表2.2所示。应该注意,重组重折叠后活性被测定的溶液条件是严格一致的,而不论在重组过程中使用了何种去污剂。从结果中看,似乎FOS-MEATM-10和CYFOSTM-3比 FOS-CHOLINER-12更优于易化DAGK的重折叠。此外,由于这些去污剂具有较高的CMC值,相比于FOS-CHOLINER-12,它们能被 更迅速地从去污剂/POPC/DAGK混合物中通过透析而除去,从而将完成重组重折叠所需时间缩短超过一天。
2.5 去污剂选择的策略和标准
2.5.1 提取
    一般地,提取膜蛋白和移除多余脂的最佳去污剂,可能并不是研究和贮存纯化态的最优选择,更不用说能高分辨率衍射的晶体的形成。一些情况下,DDM和 C12E8能用于最初的提取、纯化和蛋白质分析。较便宜级别的DDM和C12E8能用于提取过程,但是应该使用无过氧化物级别的C12E8(见 2.5.4)。
    在对常用去污剂的调查之后,大多数研究人员选择相对便宜又有合理纯度的去污剂,以适于提取和纯化的初始步骤。同时希望的是所选去污剂的CMC值在 0.5~50mM之间。如果CMC值小于0.5,可能很难将其和另一种去污剂交换;如果高于50mM,可能在提取和纯化过程中需要很高的浓度。通常使用的去污剂包括胆盐、CHAPS、TRITONR X-100和辛基葡糖苷。
2.5.2 结晶和分子研究
    能有效增溶和移除脂质的去污剂对于结晶和分子研究可能很难。天然态可能只能忍受增溶去污剂几个小时或几天,然后就会发生解折叠或聚集。因此,在纯化的适宜阶段转向一个温和的高纯度去污剂,常常是非常有利的。
    大多数能够高分辨率衍射X射线的膜蛋白晶体包含的晶格接触主要是蛋白质表面的极性部分。疏水表面与不常很有序(电子密度图中可辨认出)的去污剂分子接触。偶尔,在纯化过程中没有被移除的脂质分子将会和去污剂分子一同呈现。
    因为这些晶体实际上是一种混晶,包含去污剂分子(有时还有其他添加剂)和膜蛋白,故而去污剂的纯度极其重要。一般地,研究人员会使用最高纯度的去污剂,常常高于99%。对于可能有光学异构体的去污剂,通常建议使用异构体之一而不是混合物。最常用的烷基糖苷和麦芽糖苷存在α和β异构体,按这种分类排队。结晶 研究中使用的各种类型的去污剂包括烷基葡糖苷、烷基硫糖苷、烷基麦芽糖苷、环己基烷基麦芽糖苷、烷基二甲胺-N-氧化物、烷基二甲膦氧化物、辛基外消旋 -2,3-二羟丙基硫氧化物、辛基-2-羟乙基硫氧化物、烷基聚氧乙烯、二烷基磷脂胆碱、单烷基磷脂胆碱。
2.5.3 对去污剂溶解度和纯度的实际观察
    当我们准备的去污剂溶液在冷却到4℃常耗时超过几天时发生沉淀,是令人沮丧的。这种沉淀的可能原因如下。
2.5.3.1 试剂的联合导致沉淀
     pH和离子强度与每种成分匹配吗?有机溶剂作为成分之一可导致一些去污剂的沉淀。试着将每种成分制成溶液,在相关缓冲液中测试其溶解度。
2.5.3.2 微生物生长导致沉淀
    蛋白质研究中使用的许多试剂易发生生物降解。例如,烷基葡糖苷去污剂很容易被微生物降解,此过程可发生超过几天,会导致沉淀或悬液的出现。微生物生长可通过在缓冲液中加入1mM EDTA或非常低浓度的杀菌剂如叠氮化钠,从而被适当抑制。溶液也可通过0.2mm膜的过滤来杀菌。
2.5.3.3 合成前体的出现
    许多烷基葡糖苷和烷基麦芽糖苷含有母体醇,它也许不能在纯化过程中完全移除。当一种去污剂的浓缩溶液被制备并冷却到4℃,乳状或云雾状可能由于沉淀或醇形 成的油相而变得明显。这种情况可通过使用商业上高度纯的去污剂来避免,例如Anatrace公司的ANAGRADER去污剂,它含有少于0.005% (w/w)的母体醇,而某些相对应去污剂的商业产品则含有高达0.5%水平的母体醇。
2.5.3.4 去污剂增溶的动力学影响
    有时,当十四烷基麦芽糖苷在室温下被溶解为20%(w/v)的浓度,然而冷却到4℃,就会出现沉淀。然而,如果去污剂溶液在冷却前加热到50℃,沉淀则不 会形成。可能十四烷基麦芽糖苷在室温时形成光学上清楚的胶体,在冷却时重沉淀。因此,去污剂实际上并没有溶解。这种现象在HEGAR-10中也有发现。
2.5.3.5 过饱和
    室温下全溶的去污剂浓度可能在4℃时是过饱和的。这常在含有SDS的溶液观察到。过饱和的溶液在沉淀发生前可存在几天甚或几周。当过饱和确定无疑时,唯一的求助对象是减少去污剂浓度。
2.5.4 价值vs风险
2.5.4.1 去污剂纯度
     一般地,提取过程对去污剂纯度的要求没有蛋白质研究和结晶过程那么严格。当选择一个级别的去污剂用于提取和纯化时,可能降解或修饰蛋白质的杂质应该被避免。聚氧乙烯去污剂可能含有有机过氧化物,下一部分进行讨论。这些过氧化物可修饰蛋白质的巯基。基于糖的非离子型去污剂中的大多数杂质是不具反应性的,因 此不会在提取过程中损害膜蛋白。麦芽糖苷和葡糖苷中的杂质一般是去污剂尾巴部分的相应醇或具有非常相似结构的一种去污剂。醇的出现可导致云雾状溶液,特别是当蛋白质溶液冷却时。因为起始的脂质物质(无论是相应醇、胺或其他功能基团)含有痕量其他脂质物质,因此去污剂也同样含有与所需产物链长不同的去污剂。 在提取期间,少量近似相关的去污剂的出现应该不会出现问题。
    对于膜蛋白的生理研究和结晶,去污剂的纯度就更加重要了。一般地,最高纯度的去污剂应该被使用。多数情况下,这种去污剂选择是非离子型去污剂。纯度应该通过可靠测试如HPLC达到99%或更高。导电率应该非常低,表明几乎没有离子化杂质。对于那些没有紫外发色团的非离子型去污剂,紫外吸收和荧光背景应该非常低。相关的去污剂和脂质醇应该非常低,用HPLC或其他可靠测试检测不出。同样需要研究人员着重考虑的是,去污剂是异构体的同质物。因此,脂质麦芽糖苷和葡糖苷去污剂应该是99%α或β异构体。
2.5.4.2 在聚氧乙烯去污剂中避免杂物
     早期膜蛋白研究中使用的多数聚氧乙烯去污剂是多年前为大量工业应用而发明的。今天,更多数量的高度纯化的去污剂专门为在活性态提取膜蛋白而设计。去污剂如 DDM和辛基葡糖苷,已经代替了许多聚氧乙烯去污剂。然而对一些膜蛋白来说,聚氧乙烯去污剂仍然是有用的,特别是常规提取步骤。
     聚氧乙烯去污剂有各种结构,商品名也非常繁杂,例如TRITONR、TWEENR、GENAPOLR、BRJJR、THESITR、LUBROLR等。除 了由商品名带来的迷惑,工业去污剂通常是近似相关去污剂(形式很多)的混合物。它们也可能含有某些添加剂和污染物,从而导致蛋白质提取过程中不良影响。一种这样的添加剂是氧化剂,它能移除黄色。
     酯与氧反应形成过氧化物的趋势导致聚氧乙烯去污剂的老化。光加速这个过程。在聚氧乙烯去污剂样品中,具有各种结构的氢过氧化物和有机过氧化物都能发现。氢过氧化物等价物的浓度可高达0.2%。与之相反,可能发现过氧化物的水平随时间并没增加,因为当它们形成时就与更多去污剂分子反应,从而导致一些不良衍生物的出现。
     膜蛋白提取过程中过氧化物的出现可导致钝化或激活甚或生物材料的片段化。巯基容易被过氧化物氧化,且这种氧化诱导乙酰胆碱受体的聚集。更为复杂的是,巯基氧化涉及构象的转换,由对乙酰胆碱的高亲和力形式变为低亲和力形式。这种转换在纯化过程中已被注意到。
     去污剂溶液中的过氧化物也会对生化分析产生干扰。Lever报道说用于测定雌激素的Kober试剂能与含有过氧化物的去污剂溶液反应,甚至不用加热就可得 到棕色溶液。Heath和Tappel在测定去污剂增溶的膜成分中脂质过氧化物过氧化物时注意到高空白,过氧化物可能要对此负责。 Stutzenberger发现甚至蛋白质测定也可能受过氧化物影响,包括考马斯亮蓝染色法、二喹啉甲酸法(BCA)和Folin-酚法。
     Pierce化学公司(Surfact-AmpsR)和Anatrace公司(ANAPOER)提供的聚氧乙烯去污剂的纯化形式只含有很低水平的过氧化物。两个公司所提供产品都装在含有惰性气体的安瓿瓶内。Pierce提供六种去污剂,而Anatrace列出十四种。Anatrace去污剂通过层析纯化 至10%的溶液中只含有少于20mM的过氧化物等价物。尽管ANAPOER和Surfact-AmpR去污剂是纯化的,但是不一定是同质的。一旦打开后置于空气中,这些去污剂应该被保存在黑暗处,并在惰性气体中以避免过氧化物形成。
     Anatrace可提供同质的含有很低过氧化物的聚氧乙烯去污剂,包括C8E4(T3                         50)、C8E5(P350)、C10E5(P340)。
中原公司店小二竭诚为您服务,有任何问题请call店小二:4008100881
返回列表
无上一主题
下一主题:Anatrace——膜蛋白研究利器